Metodologia: ogólnie mierzy odpowiedź immunologiczną na kilka białek z wybranego szczepu Borrelia, kwantyfikując je łącznie dla wszystkich białek. Bada ilość specyficznych przeciwciał w surowicy wytworzonej przez krzepnięcie krwi poprzez wykrywanie ich specyficznego wiązania się z białkami (antygenami) wcześniej nałożonymi na powierzchnię. Wynik liczbowy nie zawsze jest publikowany. Często podaje się tylko wynik pozytywny/negatywny dla IgM i IgG. W przeszłości stosowano białka uzyskane poprzez rozkład bakterii Borrelia, ale obecnie dominuje stosowanie mieszaniny białek wytworzonych sztucznie na podstawie precyzyjnej genetyki (antygeny monoklonalne). Jednak ze względu na starszą metodę „fragmentacji” środowisko medyczne nadal wierzy w „niespecyficzne wiązanie”, tj. koncepcję „fałszywie dodatnich” wyników testu ELISA, co obecnie nie jest już typowe.
Co pokazuje? Mierzy poziom odpowiedzi immunologicznej na bakterie Borrelia. Ze względu na metodologię może wykrywać tylko przeciwciała wolne we krwi, więc jeśli ich poziom jest niski lub przeciwciała są związane z dużymi ilościami Borrelia, wynik będzie negatywny. Wahania poziomu przeciwciał są znanym zjawiskiem, więc różne testy mogą wykazywać różne wyniki w różnych momentach.
Do czego się nadaje? Mierzy on ostatnią (IgM) i poprzednią (IgG) odpowiedź immunologiczną na zakażenie Borrelia. W przypadkach, gdy IgM jest dodatni (u około 30-50% pacjentów), ostatnia odpowiedź immunologiczna wskazuje na aktywne zakażenie. Fałszywie dodatnie wyniki IgM są obecnie rzadkie, więc wynik dodatni zdecydowanie wskazuje na reakcję IgM na Borrelia, ale nie zawsze na niedawne zakażenie, a raczej na nowo rozwiniętą odmianę poprzedniego zakażenia. Dodatni wynik IgG może wskazywać na wcześniejsze zakażenie, ale w przypadkach przewlekłych może również wystąpić w przypadku aktywnego zakażenia, nawet jeśli reakcja IgM jest ujemna. Obecność reakcji IgG po skutecznym leczeniu może pomóc w utrzymaniu dobrego stanu zdrowia, więc u leczonych pacjentów dodatni wynik może być nawet dobrym znakiem, zwłaszcza jeśli przed leczeniem nie wystąpiła reakcja IgG.
Szybkie testy na boreliozę dostępne w aptekach (Beright, Citest, Alltest itp.)
Metodologia: Test pośredni, wizualnie wskazuje reakcję na pasku testowym (zmiana koloru), która pokazuje obecność przeciwciał (reakcja immunologiczna) przeciwko białkom wybranego szczepu Borrelia. Zasadniczo jest podobny do testów ELISA. Na Węgrzech dostępne są głównie testy łączone oparte na wykrywaniu przeciwciał IgM i IgG, a z paska testowego można odczytać tylko wyniki pozytywne/negatywne.
Co wykazuje? Obecność reakcji immunologicznej przeciwko bakteriom Borrelia. Ze względu na metodologię testu można wykryć tylko przeciwciała wolne we krwi, więc jeśli ich poziom jest niski lub przeciwciała są związane z dużymi ilościami Borrelia, wynik będzie negatywny. Wahania poziomu przeciwciał są znanym zjawiskiem, więc różne testy mogą wykazywać różne wyniki w różnych momentach.
Do czego się nadaje? Ma znacznie niższą czułość niż testy ELISA, które można wykonać w laboratorium, więc zgodnie z badaniami klinicznymi identyfikuje chorobę w 10-20 procentach przypadków. Dlatego nie nadaje się ani do potwierdzania, ani do wykluczania choroby, a jego stosowanie nie jest zalecane!
Western blot, Immunoblot, Virachip, blot, serologia Vibrant itp.
Metodologia: Test pośredni, zazwyczaj wykrywa reakcje immunologiczne przeciwko różnym białkom kilku wybranych szczepów Borrelia, przy czym dla każdego białka zachodzi oddzielna reakcja w określonym miejscu paska testowego lub multipleksu. Każda reakcja ma oddzielną wagę, a suma tych wag daje ostateczny wynik. Jeśli wyniki IgM lub IgG są powyżej progu, wynik jest pozytywny. Szczegóły poszczególnych reakcji lub wyniki nie zawsze są publikowane. Często podaje się tylko wynik dodatni/ujemny dla IgM i IgG. Niezależnie od nazwy, nowoczesne testy wykorzystują jako antygeny białka wyprodukowane w laboratorium na podstawie określonych sekwencji genów, dzięki czemu specyficzność reakcji jest wysoka, a „niespecyficzne wiązanie”, czyli wyniki „fałszywie dodatnie”, są rzadkie. Zestawy są zaprojektowane tak, aby zapewnić 100% specyficzność, ale w wielu przypadkach wyniki ujemne uzyskuje się nawet u zakażonych pacjentów.
Co to pokazuje? Obecność odpowiedzi immunologicznej na bakterię Borrelia. Ze względu na metodologię można wykryć tylko przeciwciała, które są wolne we krwi, więc jeśli ich poziom jest niski lub przeciwciała są związane z dużymi ilościami Borrelia, wynik będzie negatywny. Wahania poziomu przeciwciał są znanym zjawiskiem, więc różne testy mogą wykazywać różne wyniki w różnych momentach.
Po opublikowaniu szczegółowych wyników można wywnioskować zakres reakcji IgM/IgG na podstawie liczby białek, wobec których widoczna jest reakcja. W przypadku rozległego zniszczenia patogenów może rozwinąć się reakcja na kilka białek. W niektórych przypadkach można również zidentyfikować szczep Borrelia wywołujący zakażenie, co pozwala na spersonalizowane leczenie.
Wyraźnie przeciwwskazane i błędem zawodowym jest wskazywanie reakcji na poszczególne białka (antygeny, np. p41, OspC, VlsE) za pomocą słów pozytywny/negatywny, ponieważ może to sprawiać wrażenie, że cały wynik testu jest pozytywny. Często brakuje podsumowania wyników IgM i IgG, a podawane są tylko wyniki poszczególnych reakcji antygen-przeciwciało, co stanowi poważny błąd zawodowy. Większość testów dostarcza jedynie oddzielne wyniki IgM i IgG, a nie łączne wyniki dla całego testu.
Do czego się nadaje? Mierzy odpowiedź immunologiczną na Borrelia w odniesieniu do niedawnych (IgM) i wcześniejszych (IgG) infekcji. W przypadkach, gdy IgM jest dodatnie (u około 30-45% pacjentów), niedawna odpowiedź immunologiczna wskazuje na aktywną infekcję. Fałszywie dodatnie wyniki IgM są obecnie rzadkie, więc wynik dodatni wskazuje, że reakcja IgM jest zdecydowanie obecna, ale nie zawsze w odniesieniu do niedawnej infekcji, ale w odniesieniu do nowo rozwiniętej odmiany wcześniej przebytej infekcji. Dodatni wynik IgG może wskazywać na wcześniejsze zakażenie, ale w przypadkach przewlekłych może również wystąpić w przypadku aktywnych zakażeń, nawet jeśli reakcja IgM jest ujemna. Obecność reakcji IgG po skutecznym leczeniu może pomóc w utrzymaniu dobrego stanu zdrowia, więc u leczonych pacjentów dodatni wynik może być nawet dobrym znakiem, zwłaszcza jeśli przed leczeniem nie wystąpiła żadna reakcja. Zwiększenie zakresu reakcji może być kolejnym ważnym wskaźnikiem skuteczności leczenia.
Test transformacji limfocytów (LTT), Elispot, test aktywacji limfocytów
Metodologia: Test pośredni oparty na zasadzie, że w jednym typie białych krwinek, limfocytach, aktywacja i podział komórek zachodzą tylko wtedy, gdy napotkają one określone, tj. dokładnie „pasujące” białko (ich specyficzny antygen). Dodatnia reakcja LTT wskazuje na obecność limfocytów specyficznych dla antygenu (komórek pamięci) we krwi pacjenta, które najprawdopodobniej zostały wytworzone po napotkaniu badanego antygenu (np. białka). W przypadku boreliozy test opiera się na aktywacji i/lub proliferacji komórek pamięci T lub B specyficznych dla białek Borrelia po inkubacji komórek jednojądrzastych krwi obwodowej pacjenta (PMBC) wraz z hodowlą Borrelia i/lub białkami pochodzącymi z Borrelia w hodowli komórkowej. Metoda Elispot polega na inkubacji komórek T z wieloma antygenami i Borrelia z hodowli oraz badaniu ich aktywacji. Aktywację wskazuje produkcja określonych substancji przekaźnikowych (cytokin lub chemokin), które są wykrywane po usunięciu komórek za pomocą testu ELISA opartego na konkretnej cząsteczce. Nowszą wersją tej metody jest Fluorspot, która bezpośrednio wykrywa wytworzone substancje przekaźnikowe zamiast stosować metodę ELISA. Proces ten składa się z wielu etapów: po pierwsze, w organizmie musi już istnieć i być utrzymywana odpowiedź immunologiczna oparta na komórkach T, podczas przetwarzania próbki muszą pozostać w niej żywe komórki T, muszą one reagować na przedstawione im antygeny (np. nawet w przypadku nowego wariantu, ale reagować tylko na odpowiednie patogeny), a produkcja substancji przekaźnikowych musi być wykrywalna.
Co pokazuje? Pomyślny wynik testu pokazuje, o ile więcej komórek T lub cząsteczek przekaźnikowych jest wytwarzanych podczas inkubacji z określonymi białkami niż bez białek. W przypadku wyniku pozytywnego ilość wytworzona w próbce indukowanej jest zazwyczaj 2 lub 3 razy większa niż w próbce nieindukowanej, co wskazuje „wskaźnik stymulacji” (SI).
Do czego służy? Pokazuje z dużym prawdopodobieństwem, czy występuje odpowiedź immunologiczna komórek T na białka Borrelia, która różni się od odpowiedzi immunologicznej opartej na określonych przeciwciałach. Jeśli reakcja jest pozytywna, istnieje duża szansa, że ta odpowiedź immunologiczna pomoże w procesie leczenia. Jednak, jak pokazują publikacje podsumowujące (metaanalizy) opublikowane w ostatniej dekadzie, metoda Elispot nie nadaje się do potwierdzania faktycznego występowania infekcji u pacjenta i dlatego nie jest zalecana do celów diagnostycznych. Odsetek wyników fałszywie dodatnich i fałszywie ujemnych jest zbyt wysoki, aby można ją było stosować samodzielnie do wykrywania istniejącej infekcji, ale dostarcza ona ważnych informacji o stanie układu odpornościowego.
PCR, reakcja łańcuchowa polimerazy, diagnostyka genetyczna, NGS (sekwencjonowanie nowej generacji), sekwencjonowanie pełnego genomu (full genome sequencing)
Metodologia: Bezpośredni test wykrywający genom, tj. materiał genetyczny, DNA, patogenów obecnych w próbkach krwi lub tkanek (np. płyn stawowy, płyn mózgowo-rdzeniowy, biopsja skóry). Test PCR ma na celu amplifikację DNA patogenu z próbki przy użyciu sekwencji startowych zawierających określone fragmenty DNA poszukiwanego patogenu. Jeśli DNA patogenu nie jest obecne, sekwencja startowa (starter) nie zwiąże się z nim, a tym samym nie rozpocznie się amplifikacja poszukiwanego fragmentu genomu. Poszukiwany fragment genomu musi być na tyle ogólny, aby można było znaleźć wszystkie warianty patogenu, ale na tyle specyficzny, aby nie występował w DNA innego patogenu lub organizmu gospodarza. Test nie może wyeliminować bliskich dopasowań i może wystąpić wiele fałszywych reakcji.
Ostatnio stało się możliwe określenie całego genomu patogenu, który jest następnie porównywany z genomami znanych patogenów, ale jest to wykorzystywane głównie do celów naukowych (NGS, FGS). Testy genetyczne mogą mieć wiele źródeł błędów: niepowodzenie w izolacji DNA, niepowodzenie w usunięciu innych zanieczyszczających cząsteczek z próbki, niepowodzenie w znalezieniu pożądanego wariantu genetycznego patogenu w próbce, fałszywe wiązanie spowodowane nieodpowiednią temperaturą reakcji, zanieczyszczenie próbki kilkoma kopiami DNA w laboratorium lub w innej próbce.
Co to pokazuje? Zakłada się, że obecność materiału genetycznego patogenu wyraźnie wskazuje na obecność patogenu, ponieważ jego DNA zostanie prawdopodobnie wyeliminowane z organizmu w ciągu tygodni lub miesięcy po zniszczeniu patogenu. Granica wykrywalności testów jest bardzo niska, więc zazwyczaj mogą one wykryć obecność 1-5 patogenów na mililitr. Oznacza to również, że można wykryć przypadkowo obecny patogen, nawet jeśli nie powoduje on choroby. Dobrze zaprojektowany test (właściwa izolacja, startery, temperatura, czas itp.) wyraźnie potwierdza obecność danej sekwencji genomu w próbce. Może to potwierdzić, że diagnoza postawiona na podstawie innych testów jest prawidłowa, tj. że poszukiwany patogen jest obecny.
Do czego się nadaje? Jego czułość wynosi mniej niż 10%. Wynik pozytywny potwierdza przypadkową lub patogenną obecność bakterii – nie można ich rozróżnić, dlatego konieczne jest wykonanie innych testów o wartości diagnostycznej. W przypadku wyniku negatywnego istnieje duże prawdopodobieństwo, że patogen z poszukiwanym wariantem DNA nie jest obecny. Jednak biorąc pod uwagę dużą zmienność Borrelia burgdorferi, bakterii wywołującej boreliozę, wynik negatywny w żadnym wypadku nie wyklucza obecności innego wariantu patogenu, ponieważ patogen znacząco zmienia swój genom w cyklach 3-4 tygodniowych (rozwój nowych pokoleń). Jego wartość diagnostyczna jest niska, co wynika z zmienności genetycznej, a nie z „zniknięcia” patogenu.
Badania mikroskopowe krwi pobranej z palca, kropli krwi, nieprzetworzonej (natywnej) krwi żylnej, metoda Enderleina
Metodologia: Kropla krwi pobrana poprzez nakłucie opuszki palca umieszczana jest bezpośrednio na szkiełku mikroskopowym i badana natychmiast lub po inkubacji w wyższej temperaturze przy użyciu mikroskopu z ciemnym polem lub kontrastem fazowym. W przypadku krwi żylnej natywna, niepoddana obróbce krew jest zazwyczaj odwirowywana, a niektóre jej części lub frakcje, np. osocze, są badane pod mikroskopem. W rzadkich przypadkach stosuje się również procedury barwienia (np. Giemsa, immunofluorescencja). Test Enderleina został pierwotnie opracowany w celu obserwacji rozkładu krwi podczas inkubacji w temperaturze 30°C przez kilka godzin, a tempo rozkładu i kształty są charakterystyczne dla stanu zdrowia lub choroby pacjenta – dlatego nie nadaje się on do wykrywania konkretnych patogenów, ponieważ produkty rozkładu nie są patogenami, ale produktami sztucznymi.
Co pokazuje? Jeśli próbka nie zostanie pobrana w odpowiednio zaprojektowanym płynie, natychmiast rozpoczyna się tworzenie sztucznych produktów. Należą do nich drobne włókna utworzone z płytek krwi i czerwonych krwinek, które wydają się żywe dzięki przepływowi płynu. Nie tylko zasłaniają one patogeny, które w innym przypadku są bardzo rzadko widoczne, ale także prowadzą do błędnych diagnoz. Jednak potwierdzona obecność pojedynczego patogenu nie potwierdza poziomu infekcji ani obecności klinicznych objawów choroby.
Do czego się nadaje? Specyficzne metody barwienia (immunofluorescencja) nadają się do potwierdzania obecności określonego patogenu, ale może to mieć jedynie charakter potwierdzający, obok testu o wartości diagnostycznej (zweryfikowanego w badaniach klinicznych). Stosowanie nieodpowiednio przygotowanych metod mikroskopowych opartych na pojedynczej kropli krwi jest niedozwolone i budzi wątpliwości zawodowe. Zdjęcia i filmy najprawdopodobniej przedstawiają sztuczne produkty. W przypadku boreliozy i jej koinfekcji ani wynik pozytywny, ani negatywny nie nadają się do wyciągania jakichkolwiek wniosków lub stawiania diagnozy. Najnowsze badania potwierdzają, że te natywne badania krwi prowadzą do błędnych diagnoz.
Automatyczna mikroskopia w ciemnym polu DualDur DD-LYME 4.0 (certyfikat CE IVD, potwierdzona klinicznie)
Metodologia: Próbki krwi lub innych płynów ustrojowych (płyn stawowy, płyn mózgowo-rdzeniowy) pobrane przy użyciu specjalnego płynu do pobierania krwi (technologia komórkowa) są przechowywane w chłodnym miejscu i przygotowywane przy użyciu specjalnej metody. Próbka jest badana za pomocą automatycznego mikroskopu pod kątem obecności żywych i charakterystycznie ruchliwych bakterii krętkowych (Borrelia) skoncentrowanych ponad stukrotnie. Sztuczna inteligencja pomaga w wyborze odpowiednich kształtów, obliczaniu statystyk i upraszcza kontrolę ludzką. Automatycznie sugeruje kategorie diagnostyczne.
Co pokazuje? Specjalny płyn zapobiega tworzeniu się artefaktów od pierwszej sekundy, a preparat koncentruje mniejsze bakterie obecne w osoczu krwi, umożliwiając określenie ilości, gęstości i innych cech jakościowych bakterii Borrelia. Obecność Borrelia powyżej określonego stężenia wyraźnie wskazuje na obecność choroby. Test mierzy aktualny poziom infekcji i nie jest zależny od rozwoju odpowiedzi immunologicznej, trwającego leczenia ani stadium choroby.
Według najnowszych publikacji, po przedostaniu się do organizmu Borrelia burgdorferi jest stale obecna we krwi, ale zawsze w zmieniających się wariantach genetycznych, których nie można wykryć za pomocą innych testów. Testy PCR nie są w stanie wykryć wariantów o zmienionej genetyce po początkowej fazie, dlatego wiele badań w przeszłości prowadziło do wniosku, że Borrelia znika z krwi (mimo że tylko test PCR daje wynik negatywny). Borrelia korzysta z ciągłej obecności we krwi, ponieważ zapewnia to jej rozprzestrzenianie się przez kleszcze. Krew osoby zakażonej jest bezpiecznym środowiskiem dla Borrelia, ponieważ już rozwinięta odpowiedź immunologiczna nie ma wpływu na nowe pokolenia Borrelia, a one mogą uciec przed fagocytami dzięki większej prędkości. Jednak kształt i ruch Borrelia są stałe, więc automatyczna mikroskopia DualDur może wykryć patogen.
Mikroskopia immunofluorescencyjna DualDur barwi bakterie Borrelia burgdorferi obecne w przygotowanej próbce przeciwciałami, które wiążą się wyłącznie z bakteriami Borrelia burgdorferi, powodując ich świecenie na niebiesko-zielono, co wskazuje na obecność patogenu.
Do czego się nadaje? Test nie tylko pokazuje poziom zakażenia Borrelia (++, +, +/-, -), ale także ustala diagnostycznie prawidłową kategorię pozytywną lub negatywną (P, N). Opiera się to na największym badaniu klinicznym przeprowadzonym w Europie w dziedzinie boreliozy, które potwierdziło, że automatyczna mikroskopia DualDur była zdecydowanie najbardziej czułym z testów, a także niezawodnie specyficznym. Prawdopodobieństwo uzyskania wyniku pozytywnego u pacjenta, który faktycznie cierpi na boreliozę, wynosi 96% (wartość predykcyjna dodatnia, PPV).
Hodowla bakteryjna
Metodologia: Próbki krwi lub innych tkanek (głównie biopsje skóry z obszaru rumienia wędrującego) umieszcza się w specjalnej płynnej pożywce hodowlanej. W odpowiednich warunkach hoduje się je przez kilka tygodni w temperaturze około 33°C w środowisku ubogim w tlen, uzupełniając w tym czasie składniki odżywcze. Na koniec wyhodowany patogen identyfikuje się za pomocą mikroskopu, mikroskopii immunofluorescencyjnej lub testów genetycznych (PCR).
Co wykazuje? Obecność Borrelia burgdorferi w próbce tkanki. Niestety, badanie to jest bardzo skomplikowane, istnieje duże prawdopodobieństwo błędu, a szansa na pozytywny wynik u pacjenta z boreliozą wynosi od 10 do 20%. Jednak pozytywny wynik jest wystarczająco wiarygodnym dowodem na obecność patogenu – ale nie potwierdza stanu klinicznego pacjenta (chory lub zdrowy). Wynik negatywny nie wyklucza zakażenia.
Do czego się nadaje? Jest stosowany wyłącznie w warunkach eksperymentalnych i nie nadaje się do diagnostyki ze względu na swoją złożoność i niską czułość.
