ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), hasonló metodológiával dolgozik számos más kereskedelmi elnevezéssel rendelkező teszt pl. TickPlex, C6, Zeus, CXCL13, Euroimmun, stb.
Módszertan: általában egy kiválasztott Borrelia törzs több fehérjéje elleni immunreakciót méri, számszerűsítve, az összes fehérjére együttesen. A vérből alvadással keletkező szérumban lévő specifikus antitestek mennyiségét vizsgálja úgy, hogy azoknak az előre egy felületre felvitt fehérjékre (anitigénekre) történő specifikus csatlakozását detektálja. A számszerű eredményt nem mindig teszik közzé. Gyakran csak egy IgM és egy IgG pozitív/negatív eredmény kerül feltüntetésre. Régebben a Borrelia baktériumok feldarabolásával nyert fehérjékkel dolgoztak, ám mára már uralkodóvá vált a mesterségesen, pontos genetika alapján előállított fehérjék keverékének alkalmazása (monoklonális antigének). A régebbi „darabolós” módszer miatt azonban a mai napig fennmaradt az orvostársadalomban az „aspecifikus kötődés”, vagyis a „fals pozitív” ELISA eredmények képzete, ami ma már nem jellemző.
Mit mutat meg? A Borrelia baktérium elleni immunreakció szintjét méri. A módszertan miatt csak a vérben szabadon lévő antitesteket képes detektálni, így, ha azok szintje alacsony vagy az antitesteket a nagy mennyiségű Borrelia leköti, akkor negatív lesz az eredmény. Az antitestek hullámzása ismert jelenség, ezért a különböző tesztek más időpontokban más eredményt mutathatnak.
Mire alkalmas? A Borrelia elleni friss (IgM) és korábbi fertőzés ellen már kialakult fennmaradó (IgG) immunválaszt méri. Azon esetekben, amikor az IgM pozitív (a betegek kb. 30-50% százalékánál), a friss immunreakció aktív fertőzést mutat. Az IgM álpozitivitás ma már nem gyakori, tehát pozitív eredménynél a Borrelia elleni IgM reakció mindenképpen fennáll, viszont nem mindig egy friss fertőzés ellen, hanem a korábban kapott fertőzésnek egy újonnan létrejött variánsa ellen. A pozitív IgG eredmény korábban átvészelt fertőzésre utalhat, de krónikus esetekben aktív fertőzésnél is jelentkezhet akkor is, ha az IgM reakció éppen negatív. Az IgG reakció sikeres kezelés utáni jelenléte segíthet az egészséges állapot fenntartásában, tehát a kezelt páciensek esetén a pozitív eredmény akár jó jel is lehet, különösen akkor, ha kezelés előtt nem volt IgG reakció.
Patikában kapható Lyme gyorstesztek (Beright, Citest, Alltest, stb.)
Módszertan: Indirekt vizsgálat, egy tesztcsíkon létrejövő reakciót mutat ki vizuálisan (elszíneződéssel), amely a Borrelia egy kiválasztott törzsének fehérjéi elleni antitestek jelenlétét (immunreakciót) mutatja. Elvében hasonlít az ELISA tesztekhez. Hazánkban többnyire az IgM és az IgG ellenanyagok kimutatására alapuló kombinált tesztek kaphatók, a tesztcsíkról csak pozitív/negatív eredmény olvasható le.
Mit mutat meg? A Borrelia baktérium elleni immunreakció jelenlétét. A módszertan miatt csak a vérben szabadon lévő antitesteket képes detektálni, így, ha azok szintje alacsony vagy az antitesteket a nagy mennyiségű Borrelia leköti, akkor negatív lesz az eredmény. Az antitestek hullámzása ismert jelenség, ezért a különböző tesztek más időpontokban más eredményt mutathatnak.
Mire alkalmas? A laboratóriumban végezhető ELISA tesztekhez képest is sokkal alacsonyabb érzékenységű, ezért a klinikai vizsgálatok szerint az esetek 10-20 százalékában azonosítja a betegséget. Ezért sem a betegség igazolására, sem a kizárására nem alkalmas, használata nem javasolt!
Western blot, Immunoblot, Virachip, blot, Vibrant serology stb.
Módszertan: Indirekt vizsgálat, általában több kiválasztott Borrelia törzs különböző fehérjéi elleni immunreakciót detektálja, minden fehérjére a tesztcsík vagy multiplex adott helyén elkülönítetten születik reakció. Minden létrejövő reakció külön súlyszámmal bír, ezek összege adja ki a végeredményt. Ha az IgM vagy IgG pontszámok határérték felettiek, az eredmény pozitív. Az egyes reakciók részleteit vagy a pontszámokat nem mindig teszik közzé. Gyakran csak egy IgM és egy IgG pozitív/negatív eredmény kerül feltüntetésre. A modern tesztek, elnevezésüktől függetlenül már specifikus génszekvenciák alapján laboratóriumban előállított fehérjéket alkalmaznak antigénként, így a reakciók specifikussága magas, az „aspecifikus kötődés”, vagyis a „fals pozitív” eredmény ritka. A kittek leginkább a 100%-os specificitásra vannak tervezve, viszont így számos esetben születik negatív eredmény fertőzött páciensek esetén is.
Mit mutat meg? A Borrelia baktérium elleni immunreakció jelenlétét. A módszertan miatt csak a vérben szabadon lévő antitesteket képes detektálni, így, ha azok szintje alacsony vagy az antitesteket a nagy mennyiségű Borrelia leköti, akkor negatív lesz az eredmény. Az antitestek hullámzása ismert jelenség, ezért a különböző tesztek más időpontokban más eredményt mutathatnak.
Részletes eredmények közzététele esetén levonható belőle az IgM/IgG reakció kiterjedtsége, hogy hányféle fehérje ellen látható reakció. A kórokozók nagyfokú pusztulása esetén több fehérje ellen alakulhat ki reakció. Egyes esetekben a fertőzést okozó Borrelia törzse is megállapítható, így személyre szabott kezelés is kialakítható.
Kifejezetten ellenjavallt és szakmai hiba az egyes fehérjék (antigének pl. p41, OspC, VlsE) elleni reakciók pozitív/negatív szavakkal való feltüntetése, mert azt a képzetet kelthetik, hogy maga az egész teszt eredménye is pozitív. Sokszor hiányzik az IgM és az IgG eredmény összesítő feltüntetése, csak az egyes antigén-antitest reakciók eredményét közlik, ami súlyos szakmai hiba. A legtöbb teszt csak az IgM és az IgG elkülönített eredményét adja meg, a teljes vizsgálatra kombináltan nem ad meg eredményt.
Mire alkalmas? A Borrelia elleni friss (IgM) és korábbi fertőzés ellen kialakult (IgG) immunválaszt méri. Azon esetekben, amikor az IgM pozitív (a betegek kb. 30-45% százalékánál), a friss immunreakció aktív fertőzést mutat. Az IgM álpozitivitás ma már nem gyakori, tehát pozitív eredmény esetén az IgM reakció biztosan fennáll, viszont nem mindig egy friss fertőzés ellen, hanem a korábban elkapott fertőzésnek egy újonnan létrejött variánsa ellen. A pozitív IgG eredmény korábban átvészelt fertőzésre utalhat, de krónikus esetekben aktív fertőzésnél is jelentkezhet akkor is, ha az IgM reakció éppen negatív. Az IgG reakció sikeres kezelés utáni jelenléte segíthet az egészséges állapot fenntartásában, tehát a kezelt páciensek esetén a pozitív eredmény akár jó jel is lehet, különösen akkor, ha kezelés előtt nem volt reakció. A reakció szélességének növekedése a sikeres kezelés másik fontos ismérve lehet.
Limfocita Transzformációs Teszt (LTT), Elispot, Limfocita Aktivációs Teszt
Módszertan: Indirekt vizsgálat, amely azon az elven alapul, hogy a fehérvésejtek egyik típusában, a limfocitákban az aktiváció, illetve a sejtosztódás csak akkor történik meg, ha a specifikus, vagyis pontosan „illeszkedő” fehérjével (specifikus antigénjükkel) találkoznak. Az LTT pozitív reakciója antigén-specifikus limfociták (memóriasejtek) jelenlétét jelzi a beteg vérében, amelyek nagy valószínűséggel a vizsgálandó antigénnel (pl. egy fehérjével) való találkozás során termelődtek. Lyme-kór esetén a vizsgálat a Borrelia fehérjéire specifikus memória T- vagy B-sejtek aktiválásán és/vagy szaporodásán alapul, miután a beteg perifériás mononukleáris sejtjeit (PMBC) egy sejttenyészetben együtt inkubálták Borrelia-tenyészettel és/vagy Borreliából származó fehérjékkel. Az Elispot módszer kifejezetten többféle antigénnel és tenyészetből származó Borreliával együtt inkubálja a T-sejteket, és vizsgálja azoknak az aktiválódását. Az aktivációt bizonyos hírvivő anyagok (citokinek vagy kemokinek) termelődése jelzi, ezeket a sejtek eltávolítása után az adott molekulára épülő ELISA teszttel mutatják ki. Ennek újabb verziója a Fluorspot, amely az ELISA módszer helyett közvetlenül detektálja a képződött hírvivő anyagokat. A folyamat többszörösen áttett, először is szükséges hozzá, hogy a szervezetben már kialakuljon és fennmaradjon a T-sejtekre épülő immunreakció, a mintában maradjanak életképes T-sejtek a feldolgozáskor, azok reagáljanak a számukra prezentált antigénekre (pl. egy újfajta variáns esetén is, de csak releváns kórokozókra reagáljanak), és a hírvivő anyagok termelődését detektálni lehessen.
Mit mutat meg? Sikeres vizsgálatnál mérhető, hogy a specifikus fehérjékkel való együttes inkubáció esetén mennyivel több T-sejt vagy hírvivő molekula termelődik, mint a fehérjék nélkül. Általában pozitív tesztnél az indukált mintában termelődött mennyiség 2 vagy 3 szorosa a nem indukált mintáénak, ennek jelzésére szolgál a „Stimulációs Index”, SI.
Mire alkalmas? Nagy valószínűséggel megmutatja, hogy a Borrelia fehérjéi ellen van-e kiváltható T-sejtes immunválasz, ami folyamatában más, mint a specifikus antitestekre épülő immunválasz. Amennyiben a reakció pozitív, akkor jó eséllyel számíthatunk ezen immunválasz segítségére a gyógyulás folyamatában. Amint azt az utóbbi évtizedben megjelent összesítő publikációk (metaanalízisek) bemutatták, az Elispot módszer nem alkalmas viszont arra, hogy igazolja a páciensben ténylegesen jelen lévő fertőzést, így diagnosztikus célra alkalmazása nem javasolt. A fals pozitív és a fals negatív eredmények aránya is túlságosan nagy ahhoz, hogy az éppen fennálló fertőzés megállapítására önállóan alkalmazni lehessen, ám az immunrendszer állapotáról fontos információkat közöl.
PCR, Polymerase Chain Reaction, genetikai diagnosztika, NGS (Next Generation Sequencing), Full Genome Sequencing (teljes genom szekvenálás)
Módszertan: Direkt teszt, amely a vér- vagy szövetmintában (pl. ízületi folyadék, agy-gerincvelői folyadék, bőr-biopszia) jelen lévő kórokozók genomját, azaz örökítőanyagát, DNS-ét mutatja ki. A PCR vizsgálat egy keresendő kórokozó DNS-ének bizonyos részeit tartalmazó kiinduló szekvenciákhoz próbálja meg a mintából sokszorosítani a kórokozó DNS-ét. Ha a kórokozó DNS-e nincs jelen, akkor a kiinduló szekvencia (primer) nem kapcsolódik hozzá és így nem indul be a keresett genom-részlet sokszorosítása. A keresett genom-részletnek eléggé általánosnak kell lennie ahhoz, hogy minden kórokozó-variánst megtaláljon, de elég specifikusnak ahhoz, hogy ne legyen benne egy másik kórokozó vagy a gazdaszervezet DNS-ében. A közeli egyezéseket a teszt nem tudja kiküszöbölni, illetve számos fals reakció is kialakulhat.
Újabban a kórokozó teljes genomjának a meghatározása is elérhető, amely után megpróbálják azt hasonlítani már ismert kórokozók genomjához, ám ezeket főképp tudományos céllal alkalmazzák (NGS, FGS). A genetikai teszteknek számos hibaforrása lehet: nem sikerül a DNS izolálása, a mintából nem sikerült eltávolítani az egyéb szennyező molekulákat, a mintában a kórokozónak nem a keresett genetikai variánsa található meg, téves kötődés alakul ki nem megfelelő reakcióhőmérséklet miatt, a laborban vagy egy másik mintában lévő néhány kópiányi DNS beszennyezi a mintát.
Mit mutat meg? Feltételezik, hogy a kórokozó örökítőanyagának jelenléte egyértelműen utal a kórokozó jelenlétére, mivel a kórokozó pusztulása után nagy valószínűséggel a DNS-e is hetek-hónapok alatt kiürül a szervezetből. A tesztek kimutathatósági határa nagyon alacsony, így általában már 1-5 kórokozó jelenlétét ki tudja mutatni milliliterenként. Ebből az is következik, hogy egy véletlenszerűen jelenlévő kórokozó is kimutatásra kerülhet, noha az nem okoz betegséget. Jól megtervezett teszt (megfelelő izolálás, primerek, hőmérséklet, idő stb.) esetén egyértelműen igazolja az adott genomszekvencia jelenlétét a mintában. Ez megerősítheti, hogy a más vizsgálatokkal felállított diagnózis helyes, vagyis specifikusan pont a keresett kórokozó van jelen.
Mire alkalmas? Érzékenysége 10% alatti. Pozitív teszt megerősíti a baktériumnak a véletlenszerű vagy kórt okozó jelenlétét – e kettő nem különböztethető meg, ezért más, diagnosztikus értékű teszt elvégzése kötelező. Azokban az esetekben, amikor negatív, nagy valószínűséggel a keresett DNS-variánsú kórokozó nincs jelen. Viszont kiemelten a Borrelia burgdorferi, a Lyme-kórt okozó baktérium nagymértékű változékonyságára tekintettel, a negatív eredmény semmiképpen sem zárja ki a kórokozó másik variánsának jelenlétét, ugyanis a kórokozó 3-4 hetes ciklusokban nagymértékben megváltoztatja a genomját (új generációk kifejlődése). Diagnosztikus haszna csekély, ami a genetikai változékonyságnak, és nem a kórokozó „eltűnésének” köszönhető.
Mikroszkópos tesztek ujjbegyvérből, egy csepp vérből, kezeletlen (natív) vénás vérből, Enderlein-módszer
Módszertan: Az ujjbegy megszúrásával nyert vércseppet közvetlenül mikroszkópos tárgylemezre teszik és azonnal vagy magasabb hőmérsékleten történt inkubálás után vizsgálják sötétlátóteres vagy fáziskontraszt-mikroszkóppal. Vénás vér esetén általában a natív kezeletlen vért centrifugálják le, és annak bizonyos részeit, frakcióit, pl. plazma, vizsgálják mikroszkóp alatt. Ritkán festési eljárásokat is alkalmaznak (pl. Giemsa, immunfluoreszcencia). Az Enderlein-féle vizsgálat eredetileg arra lett kifejlesztve, hogy a vérminta 30°C fölötti, órákon át tartó inkubálása során a vér kezd lebomlani, és a bomlás sebessége, az alakzatok jellemzőek a páciens egészséges vagy beteg állapotára – így ez konkrét kórokozók kimutatására nem alkalmas, mivel a bomlástermékek nem kórokozók, hanem műtermékek.
Mit mutat meg? Amennyiben a mintát nem egy megfelelően megtervezett folyadékba veszik, akkor azonnal elkezdődik a műtermékek keletkezése. Ezek a többek között a vérlemezkékből és a vörösvértestekből kialakuló finom szálak, baktériumszerű képződmények a folyadékáramok miatt élőnek tűnnek. Nemcsak eltakarják a nagyon ritkán egyébként látható kórokozókat, hanem téves diagnózisra adnak lehetőséget. Mindamellett egyetlen kórokozó igazolt jelenléte még nem igazolja a fertőzöttség szintjét, a betegség klinikai tüneteinek jelenlétét.
Mire alkalmas? A specifikus festési módszerek (immunfluoreszcencia) alkalmasak arra, hogy a konkrét kórokozó jelenlétét igazolják, de ez csak megerősítő jellegű lehet egy diagnosztikus értékű (klinikai kutatásban igazolt) teszt mellett. A nem megfelelően előkészített, egy-csepp-vér alapú mikroszkópos módszerek használata nem megengedett, szakmailag megkérdőjelezhető. A képek, videók nagy valószínűséggel műtermékeket mutatnak. Lyme-kór és társfertőzései esetén sem a pozitív, sem a negatív eredmény nem alkalmas semmilyen következtetés levonására vagy diagnózis felállítására. A legújabb tanulmányok megerősítik, hogy ezek a natív vérvizsgálatok téves diagnózist állítanak fel.
DualDur DD-LYME 4.0 automata sötétlátóteres mikroszkópia (CE IVD minősítéssel, klinikailag igazolt)
Módszertan: A speciális vérvételi (sejttechnológiai) folyadékba levett vérmintát vagy egyéb testfolyadékmintát (ízületi folyadék, agy-gerincvelői folyadék) hűtve tárolják és speciális módszerrel készítik elő. A mintából több mint százszorosan koncentrált, élő és jellegzetesen mozgó spirochéta baktériumokat (Borrelia) automata mikroszkóp vizsgálja. A mesterséges intelligencia segít a megfelelő alakzatok kiválasztásában, a statisztikák számításában, és az emberi ellenőrzést egyszerűbbé teszi. A diagnosztikus kategóriákat önműködően javasolja.
Mit mutat meg? A speciális folyadék megakadályozza a műtermékek keletkezését az első másodperctől kezdve, az előkészítés pedig a vérplazmában jelenlévő apróbb baktériumokat koncentrálja, így a Borrelia baktériumok mennyisége, sűrűsége, és egyéb minőségi jellemzői meghatározhatók. A Borreliák egy adott koncentráció feletti jelenléte egyértelműen utal a betegség fennállására. A vizsgálat az éppen aktuálisan fennálló fertőzés szintjét méri, nem függ az immunreakció kialakulásától, éppen folyamatban lévő kezeléstől, a betegség stádiumától.
A legfrissebb publikációk szerint a Borrelia burgdorferi a szervezetbe kerülve a vérben folyamatosan jelen van, azonban mindig változó genetikai variánsokkal, amelyeket más tesztek nem tudnak kimutatni. A PCR vizsgálatok a kezdeti stádium után nem tudják érzékelni a megváltozott genetikájú variánsokat, ezért sok tanulmány régebben arra a következtetésre jutott, hogy a Borrelia tűnik el a vérből (pedig csak a PCR vizsgálat válik negatívvá). A Borreliának előnyt jelent a vérben való folyamatos jelenlét, hiszen azzal biztosítja a kullancsok általi terjedést. A fertőzött személy vére biztonságos környezet a Borrelia számára, hiszen a már kialakult immunválasz nem hat a Borreliák újabb és újabb generációira, a falósejtek elől pedig nagyobb sebességük miatt tudnak elmenekülni. A Borrelia alakja és mozgása viszont állandó, így a DualDur automata mikroszkópia megtalálja a kórokozót.
A DualDur Immunfluoreszcencia mikroszkópia az előkészített mintában jelen lévő Borrelia burgdorferi baktériumokat festi meg specifikusan, olyan antitestekkel, amelyek csak Borrelia burgdorferi baktériumokhoz kapcsolódnak, így azok kékeszölden világítva jelzik a keresett kórokozót.
Mire alkalmas? A vizsgálat nemcsak a Borrelia-fertőzés szintjét mutatja meg (++, +, +/-, -), hanem diagnosztikailag korrekt pozitív vagy negatív kategóriát is felállít (P, N). Ennek alapja a Lyme-kór területén Európában végzett legnagyobb klinikai kutatás, amely igazolta, hogy a tesztek közül kimagaslóan a legérzékenyebb volt a DualDur automata mikroszkópia, emellett megbízhatóan specifikus. Annak a valószínűsége, hogy egy valóban Lyme-kórban szenvedő betegnél pozitív eredmény születik 96% (pozitív prediktív érték, PPV).
Baktériumtenyésztés
Módszertan: A vér vagy egyéb szövetmintát (elsősorban bőr-biopsziát a kokárdaszerű bőrgyulladás területéről) speciális folyadékra, táptalajra veszik le. Megfelelő körülmények között, 33°C körül oxigénszegény környezetben heteken át tenyésztik, közben pótolják a tápanyagokat. Végül mikroszkóppal, immunfluoreszcencia-mikroszkópiával vagy genetikai vizsgálat (PCR) segítségével azonosítják a kitenyészett kórokozót.
Mit mutat meg? A Borrelia burgdorferi jelenlétét a szövetmintában. Sajnos elvégzése nagyon bonyolult, sok a hibalehetőség és 10-20% közötti az esélye a pozitív eredménynek egy Lyme-kórban szenvedő páciens esetén. A pozitív eredmény azonban megfelelően megbízható bizonyíték arra, hogy a kórokozó jelen van – de nem igazolja a páciens klinikai állapotát (beteg vagy egészséges). A negatív eredmény nem zárja ki a fertőzést.
Mire alkalmas? Csak kísérleti környezetben alkalmazzák, diagnosztikára nem alkalmas a bonyolultsága és az alacsony érzékenysége miatt.
